| Résumé | La production rapide et efficace de protéines recombinantes pour effectuer des études structurales et fonctionnelles constitue un aspect crucial dans les milieux de la recherche et de l’industrie. À cette fin, nous avons mis au point un système efficace qui permet de produire en moins de deux mois, à partir d’ADNc, des pools de cellules CHO qui expriment de façon stable des quantités importantes de protéines recombinantes. Ce système repose sur des vecteurs lentiviraux (LV), pour assurer une stabilité de la transduction, combinés avec le commutateur génétique régulé par le cumate pour assurer une expression génétique inductible et efficace. La transcription débute par la liaison du transactivateur au cumate (cTA) ou du cTA inversé (rcTA) au promoteur CR5. L’ajout du cumate permet d’empêcher ou d’induire la liaison du cTA ou du rcTA respectivement. Nous avons d’abord validé le système de production CHO/LV au moyen d’un LV transportant la phosphatase alcaline sécrétée ou SEAP [secreted alkaline phosphatase], dont l’expression est liée à la protéine de fluorescence verte ou GFP [green fluorescent protein] grâce à une séquence IRES [internal ribosome entry site]. Nous avons transduit les cellules CHO exprimant de façon stable le cTA (CHO cTA) à des multiplicités d’infection ou MOI [multiplicity of infection] différentes. Des pools de cellules ont été incubés à 37 et à 30 oC pendant dix jours. La production optimale de SEAP (65 μg/ml) a été obtenue à 30 oC et à une MOI de 200. L’analyse de l’expression de la GFP a permis de démontrer la stabilité du pool après 48 jours de culture. Nous avons également évalué le système au moyen d’un LV exprimant trois protéines thérapeutiques types (une protéine composée du domaine extracellulaire de CD200 fusionné à la région Fc de l’IgG [CD200Fc], un anticorps chimère [chB43] et l’érythropoïétine [EPO]). Les cellules CHO exprimant le rcTA (CHO Cum2) ont été transduites par ces LV à une MOI de 200, et la production a été effectuée à 30 oC. Après 13 jours de culture, nous avons obtenu une production de 235 mg/ml de CD200Fc, de 160 mg/ml de chB43 et de 206 mg/ml d’EPO. Le rapport ON/OFF [ON/OFF ratio] de ces pools était de 6 pour la CD200Fc, de 16 pour le chB43 et de 74 pour l’EPO. En conclusion, ce système devrait être très utile pour produire des quantités de l’ordre du milligramme de protéines recombinantes en temps voulu dans une culture de cellules CHO en suspension dans un milieu sans sérum en vue d’études précliniques. |
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